Aplicación de un método in house para el estudio de la esclerosis múltiple / Application of an in-house method for the study of multiple sclerosis

Resumen El método de referencia para el estudio bioquímico de la esclerosis múltiple (EM) es el isoelectroenfoque (IEE) y la evaluación de las cadenas livianas libres (CLL) podría brindar una información adicional de relevancia. Por lo tanto, se propone evaluar la presencia de las CLL y la aplicabilidad de los estados de polimerización en el estudio de la EM. Se puso a punto un método compuesto por una separación electroforética en gel de poliacrilamida al 12,5% con posterior electrotransferencia (PAGE-WB) y se realizó la evaluación de 121 pacientes con sospecha de EM en simultáneo al IEE. Los patrones de PAGE-WB relacionados con la EM fueron el aumento de la concentración de monómeros Kappa o dímeros Lambda en líquido cefalorraquídeo (LCR) en comparación con el suero. Este método tuvo una muy alta significación de asociación con el IEE (p<0,0001) con sensibilidad del 95%, especificidad del 90%, VPP 83% y VPN 97%. La síntesis intratecal de CLL quedó evidenciada por el aumento de intensidad del monómero Kappa y/o el dímero Lambda observado en LCR. La técnica de PAGE-WB para CLL demostró ser un método alternativo para detectar la síntesis intratecal en pacientes con sospecha de EM.

Abstract The reference method for the biochemical study of multiple sclerosis (MS) is isoelectric focusing (IEF) and the evaluation of free light chains (FLC) could provide additional information of relevance. Therefore, it is proposed here to evaluate the presence of FLC and the applicability of the polymerisation states in the study of MS. A method consisting of a 12.5% polyacrylamide gel electrophoretic separation with a subsequent electrotransfer (PAGE-WB) was developed and the evaluation of 121 patients with suspected MS was carried out simultaneously with the IEF. MS-related PAGE-WB patterns were the increase in the concentration of Kappa monomers or Lambda dimers in CSF compared to serum. This method had a very high significance of association with the IEF (p<0.0001) with 95% sensitivity, 90% specificity, 83% PPV and 97% NPV. Intrathecal synthesis of FLC was evidenced by the increased intensity of the Kappa monomers and/or Lambda dimers observed in CSF. The PAGE-WB technique for FLC proved to be an alternative method to detect intrathecal synthesis in patients with suspected MS.

Resumo O método de referência para o estudo bioquímico da esclerose múltipla (EM) é a focalização isoelétrica (IEE) e a avaliação de cadeias leves livres (CLL) poderiam fornecer informações adicionais de relevância. Assim, propõe-se avaliar a presença das CLL e a aplicabilidade dos estados de polimerização no estudo de EM. Foi desenvolvido um método que consiste na separação eletroforética em gel de poliacrilamida a 12,5% com posterior eletrotranferência (PAGE-WB) e a avaliação de 121 pacientes com suspeita de EM foi realizada paralelamente à IEE. Os padrões de PAGE-WB relacionados com a EM foram o aumento na concentração de monômeros Kappa ou dímeros Lambda em líquido cefalorraquidiano (LCR) em comparação com o soro. Este método teve uma associação de significância muito alta com o IEE (p<0,0001) com sensibilidade de 95%, especificidade de 90%, VPP 83% e VPN 97%. A síntese intratecal de CLL foi evidenciada pelo aumento de intensidade do monômero Kappa e/ou dímero Lambda observado em LCR. A técnica PAGE-WB para CLL mostrou-se um método alternativo para detectar a síntese intratecal em pacientes com suspeita de EM.

El rol de la proteína beta trace en distintas áreas de la Medicina / The role of beta trace protein in different areas of Medicine / O papel da proteína beta trace em diferentes áreas da Medicina

La proteína beta trace (PBT), también llamada Prostaglandina D2 Sintasa de tipo lipocalina, es una glicoproteína de peso molecular entre 23 y 29 kDa que convierte la prostaglandina H2 en prostaglandina D2. La misma está asociada a diferentes entidades clínicas. Por sus características moleculares puede ser un indicador útil de la alteración precoz en la filtración glomerular; por el aumento de su síntesis y su concomitante elevación en suero, un predictor de riesgo cardiovascular; y por su alta concentración en líquido cefalorraquídeo (LCR), un biomarcador de fístula de LCR. Puede medirse en distintos líquidos biológicos, como suero, orina y LCR. El objetivo de esta revisión fue actualizar los conocimientos de esta proteína para evaluar su utilidad en distintas áreas de la Medicina. La trascendencia de PBT en el campo de la bioquímica como posible biomarcador dependerá de la patología de base del paciente.

The beta trace protein (BTP), also called Prostaglandin D2 Synthase lipocalin type PGDS, is a glycoprotein between 23 and 29 kDa of low molecular weight that converts prostaglandin H2 in prostaglandin D2. BTP is a protein that has multiple clinical associations. Due to the characteristics of the molecule, it may indicate an early alteration in glomerular filtration; by the serum increase of its synthesis, it is a predictor of cardiovascular risk, and for its high concentration in cerebrospinal fluid (CSF), it is a marker of leakage. This protein can be measured in different biological fluids such as serum, urine, and CSF. The objective of this review is to update the knowledge about this protein as a biomarker. The significance of BTP in the field of biochemistry as a possible biomarker will depend on the patient's underlying pathology.

A proteína beta trace (PBT), também chamada de Prostaglandina D2, sintase de lipocalina é uma glicoproteína de peso molecular entre 23 e 29 kDa, que converte prostaglandina H2 em prostaglandina D2. PBT é uma proteína que está associada a várias entidades clínicas. Devido às características moleculares, pode ser uma indicação útil da alteração precoce na filtração glomerular, devido ao aumento de sua síntese e sua concomitante elevação em soro, um preditor de risco cardiovascular e, devido à sua alta concentração no líquido cefalorraquidiano (LCR), é um biomarcador da fístula LCR. É uma proteína que pode ser medida em diferentes fluidos biológicos, como soro, urina e LCR, e o objetivo desta revisão foi atualizar os conhecimentos desta proteína para avaliar sua utilidade em diversas áreas da medicina. A importância de PBT no campo da bioquímica como possível biomarcador dependerá da patologia subjacente do paciente.

¿Es posible diferenciar líquido cefalorraquídeo de otras secreciones? Utilidad de la proteína Beta Trace como biomarcador de fístulas de líquido cefalorraquídeo / Is it possible to differentiate cerebrospinal fluid from other secretions? Usefulness of Beta Trace protein as a biomarker of cerebrospinal fluid fistulas

Objetivo: Describir el uso de la proteína Beta Trace (PBT) como marcador de líquido cefalorraquídeo (LCR) en una serie de casos de pacientes con sospecha de fístula de LCR (FLCR). Materiales y Métodos: Se realizó un estudio retrospectivo con datos recolectados en forma prospectiva, observacional y descriptiva. Se revisaron las historias clínicas, estudio por imágenes y datos de laboratorio de una serie de 19 pacientes con sospecha de FLCR en los cuales se había realizado la detección de la PBT mediante electroforesis bidimensional, entre julio 2015-julio 2018. Resultado: La edad promedio fue de 48,1 años, 9 fueron hombres y 10 mujeres, 10 pacientes provenían de neurocirugía, 7 de otorrinolaringología (ORL), y 2 de traumatología (OyT). De las 19 muestras, 14 fueron positivas para la detección de PBT. Cinco casos (26.32%) presentaron antecedente de meningitis, todos ellos con PBT positivo. De los casos positivos, 14 fueron tratados, 3 sin cirugía y 11 con cirugía. La principal causa fue post quirúrgica (n=9). El seguimiento promedio fue de 13,79 meses, 13 casos tuvieron resultado "favorable" y uno "desfavorable". Los 5 casos con PBT negativa fueron tratados con medidas no quirúrgicas. Todos con resultado "favorable". Conclusión: La PBT permitió, en los casos positivos, detectar LCR en las secreciones estudiadas, y en los negativos, descartarla.

Objective: To describe the use of beta-trace protein (BTP) as a cerebrospinal fluid (CSF) marker in patients with suspected CSF leakage. Methods and Materials: A retrospective study was conducted using data previously collected for a prospective, observational study. Data included the case records, imaging studies and laboratory data from a series of 19 patients with suspected CSF leakage in whom two-dimensional electrophoresis was performed for BTP detection, between July 2015 and July 2018. Results: Average patient age was 48.1 years old, with nine males and ten females. Ten patients were from neurosurgery, seven from otorhinolaryngology (ENT), and two from traumatology. Of the 19 samples, 14 were positive for BTP. Nine of the patients (47.4%) sustained their CSF leakage during surgery. Five patients (26.3%) had a history of meningitis, all with positive BTP. All 14 BTP-positive cases were treated, three without and 11 with surgery. Average post-operative follow-up was 13.8 months, with 13 patients experiencing a "favorable" and one "unfavorable" outcome. All five patients who screened negative for BTP were treated non-surgically and had a favorable outcome. Conclusions: In patients in whom BTP was identified, the marker was useful for detecting CSF in the secretions studied. Amongst those who screened negative for BTP, its absence helped to rule out the presence of a CSF leak.

Hemoglobinuria paroxística nocturna. el rol de la anhidrasa carbónica-i urinaria en la hemólisis intravascular / Peroxysmal nocturnal hemoglobinuria: the role of urinary carbonic anhydrase-I in intravascular haemolysis

La Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) se caracteriza por hemólisis intravascular crónica mediada por complemento. Cuando se produce la hemolisis se libera a circulación Anhidrasa Carbónica- I (AC-I), una enzima que se halla en alta concentración en el eritrocito y por su bajo peso molecular filtra por el glomérulo. El objetivo del presente trabajo fue detectar la excreción de la AC-I en orina de pacientes con HPN por Electroforesis Bidimensional de Utilidad Clínica (2D UC), y compararla con otras causas de hemólisis, de origen renal y postrenal. Se evaluaron 8 pacientes con HPN sin tratamiento con eculizumab un inhibidor del C5 del complemento, y 5 de ellos postratamiento, 12 orinas de pacientes con nefritis lúpica y 10 orinas de pacientes con hemólisis postrenal. La AC-I puede estar presente en la orina, en los tres grupos, sin embargo la relación AC-I/Hemoglobina en la hemólisis intravascular está invertida en comparación con la hemolisis glomerular y post-renal. Los pacientes con HPN tratados con eculizumab no presentan AC-I, y sería de utilidad en el seguimiento de los pacientes tratados con el inhibidor del C5, para evidenciar posibles escapes hemolíticos.

Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) is characterized by chronic complement mediated haemolysis. In these conditions it might be expected that carbonic anhydrase-I (AC-I) would be liberated into the plasma and excreted in the urine, by its high concentration in the erythrocyte and low molecular weight. The objective of the present study was to detect the urinary excretion of AC-I from patients with PNH by wodimensional clinical utility electrophoresis (2D UC) and to compare it with other causes of renal and post-renal haemolysis. We evaluated 8 patients with PNH without eculizumab, a complement C5 inhibitor, 5 of them posttreatment, 12 urine of patients with lupus nephritis and 10 urine of patients with post-renal hemolysis. AC-I may be present in the urine, in all three groups, however, the AC-I/Haemoglobin ratio in intravascular haemolysis is reversed compared to glomerular and post-renal haemolysis. Patients with PNH treated with eculizumab do not have AC-I and would be useful in monitoring patients treated with the C5 inhibitor to evidence possible haemolytic leaks.

Microproteínas urinarias marcadoras de daño renal en pacientes con glomerulopatías / Urinary microprotein markers of renal disease in patients with glomerulopathies / Microproteínas urinárias marcadoras de lesão renal em pacientes com glomerulopatias

En las glomerulopatías, las Microproteínas Urinarias (MU) se eliminan por distintos mecanismos fisiopatológicos. El objetivo del trabajo fue correlacionar las MU con el daño histológico evaluado en la punción biopsia renal (PBR) de pacientes con diversas glomerulopatías. Se estudiaron 44 orinas espontáneas (33 mujeres y 11 varones) entre 18 y 71 años de edad, por el método de electroforesis bidimensional de uso clínico (2D UC). Las proteínas identificadas se dividieron en 5 grupos y se compararon con lesiones vasculares, glomerulares y túbulointersticiales; estas dos últimas se dividieron en crónicas y agudas. Las del grupo identificado como las "Tres Marías" (fragmento de 35 kDa de la proteína inhibidor de tripsina cadena pesada H4, Prostaglandina H2 sintasa y fragmento de 23 kDa del Perlecan) resultaron no ser marcadoras de daño tubular, sino de alteraciones glomerulares crónicas. La presencia de las mismas, con proteinuria, se observa antes de la caída de la filtración glomerular (<60 mL/min) y correlaciona con el 30% de glomérulos totalmente esclerosados (p<0,001). El grupo Triángulo, en la glomerulopatía, contiene a la Alfa-1 microglobulina (A1m) y a las cadenas livianas libres de Inmunoglobulinas (CLL), e indica lesión glomerular activa. Por lo tanto, las MU en glomerulopatías, responden a lesiones glomerulares activas y crónicas. Los perfiles proteicos urinarios hallados por la 2D UC permitieron conocer el grado de lesión en los distintos compartimentos renales.

In Glomerulopathies, urinary microproteins (UM) are eliminated by different pathophysiological mechanisms. The objective of this work was to correlate the UM with the histological damage evaluated in the renal biopsy through puncture of patients with various glomerular diseases. Forty-four urine samples (33 females, 11 males) aged 18 to 71 years old were studied by the method of two-dimensional electrophoresis of clinical use (2D UC). The identified proteins were divided into 5 groups and were compared with vascular injury, glomerular and tubulointerstitial injury, the latter in chronic and acute cases. The group identified as the "Three Marias" (fragment 35 kDa protein trypsin inhibitor heavy chain H4, prostaglandin H2 synthase and 23 kDa fragment of Perlecan), was not found as marker of tubular damage, but it was found in chronic glomerular disorders. The presence of this same group -with proteinuria- is seen before the collapse of the glomerular filtration rate (<60 mL/min) and it is correlated with 30% of fully sclerotic glomeruli (p<0.001). In glomerulopathy, the Triangle group: Alpha-1 microglobulin (A1m) and free Immunoglobulin light chains (FLC), indicates active glomerular injury. Therefore, the UM in glomerular diseases, respond to active and chronic glomerular lesions. Urinary protein profiles found by the 2D UC made it possible to know the degree of renal injury in different renal compartments.

Nas glomerulopatias, as Micro proteínas Urinárias (MU) são eliminadas através de diferentes mecanismos fisiológicos. O objetivo do trabalho foi relacionar as MU com o dano histológico avaliado na punção biópsia renal (PBR) de pacientes com diversas glomerulopatias. Foram estudadas 44 urinas espontâneas (33 mulheres e 11 homens entre 18 e 71 anos de idade), pelo método de eletroforese bidimensional de uso clínico (2D UC). As proteínas identificadas foram divididas em 5 grupos e comparadas com lesões vasculares, glomerulares e túbulo-intersticiais, estas duas últimas classificadas em crônicas e agudas. O grupo identificado como as "Três Marias" (fragmento de 35 kDa da proteína inibidora de tripsina cadeia pesada H4, Prostaglandina H2 sintase e fragmento de 23 kDa do Perlecam), resultaram não ser marcadoras de dano tubular, mas de alterações glomerulares crônicas. A presença de tais proteínas, com proteinúria, observa-se antes da queda da filtragem glomerular (<60 mL/min) e correlaciona com 30% de glomérulos totalmente esclerosados (p<0,001). O grupo Triângulo, na glomerulopatia, que contém a Alfa-1 microglobulina (A1m) e as cadeias leves livres de Imunoglobulinas (CLL) indicam lesão glomerular ativa. Portanto, as MU em glomerulopatias respondem a lesões glomerulares ativas e crônicas. Os perfis proteicos urinários encontrados pela 2D UC permitiram conhecer o grau de lesão nos diferentes compartimentos renais.

Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos / Urinary microproteins in normoalbuminuric type 2 diabetic patients / Microproteínas urinárias em diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 kDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron en geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La identificación de las MU se realizó por “immunoblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoalbuminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Urinary excretion of microproteins (MU) was detected in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, in the range of 68-25 kDa using SDS-PAGE with silver staining. The purpose of this study was to identify MU in diabetic patients in different grades of diabetic nephropathy, in order to clarify the diagnostic relevance as a marker of renal tubular damage. In the spontaneous urine of 119 type 2 diabetic patients, urinary albumin, urinary creatinine and serum were determined. Five groups were formed: 71 normoalbuminuric, 28 microalbuminuric, 12 macroalbuminuric, 2 in pre-dialysis and 6 in hemodialysis. The MU were separated by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis for clinical use (2D UC) and were identified by immunoblotting or MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and analyzed using Image J version 1.30v. Of the normoalbuminurics patients studied, 66% excreted the following MU: orosomucoid, 35 kDa fragment of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and Beta Trace; but their concentrations did not reflect tubular damage because they exhibited a progressive downregulation. These proteins are involved in vascular endothelium, and they could be a marker of renal tubular-microvascular disease that would be useful in systemic diseases with cardiovascular risk and with preserved renal function.

Em pacientes diabéticos tipo 2 “normoalbuminúricos” se observa a presença de microproteínas urinárias (MU) em um intervalo compreendido entre 68 e 25 kDa. O objetivo do trabalho é identificar em distintos estágios da nefropatia diabética se tal intervalo corresponde a um marcador de dano tubular. Foram estudadas 119 amostras de urina espontânea de pacientes diabéticos tipo 2; foi medida a reação albumina/creatinina urinária e a creatinina sérica. Dividiram-se em 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urêmicos pré-dialise e 6 em hemodiálise. Foram detectadas as MU em géis de poliacrilamida em duas dimensões para o uso clínico e analisadas com o programa Image J versão 1.30v. A identificação das MU foi realizada por “immunoblotting” ou por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. 66% de normoalbuminúricos apresentaram as seguintes MU: orosomucoide, Fragmento de 35 kDa da cadeia pesada H4 do interalfa inibidor da tripsina e Beta Trace, as quais não mostraram dano tubular devido a que a concentração das mesmas não está aumentada nos pacientes em hemodiálise, em comparação com os normoalbuminúricos. Estas proteínas estão envolvidas com o endotélio vascular e poderiam constituir um marcador urinário vascular-tubular renal de utilidade clínica em patologias sistêmicas com risco cardiovascular e funcionalidade renal conservada.

Proteinuria: lesión estructural renal y comparación de métodos / Proteinuria: renal structural injury and comparison of methods / Proteinúria: lesão estrutural renal e comparação de métodos

La proteinuria (PT-ur) es un marcador de enfermedad renal, sin un método de referencia establecido. Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción argéntica pueden identificarse de manera no-invasiva perfiles proteicos urinarios (PPU) de tipo glomerular (G), tubular (Tc: completos, Ti: incompletos) y mixtos (GTc, GTi) con fines diagnósticos/pronósticos y de evolución. El objetivo del estudio fue determinar la prevalencia (P) de los PPU para cada nivel de PT-ur obtenido con cuatro métodos diferentes, en pacientes con sospecha de lesión renal. Se procesaron 105 orinas de 24 h de recolección clasificadas mediante tira reactiva (TR) y 2 pacientes con proteinuria de Bence Jones (PBJ)>2 g/L. La cuantificación de PT-ur se realizó con ácido sulfosalicílico (SSA) y Bradford (CBB) "in-house"; cloruro de benzetonio (BZT-Roche) y rojo de pirogallol-molibdato (PRM-Wiener)-Hitachi 917. Se realizó uroproteinograma y SDS-PAGE. Los cuatro métodos presentaron correlación significativa (p<0,05) para PT-ur y una comparación de medias estadísticamente no-significativa en todos los niveles de TR. Para TR negativa (PT-ur en rango normal), la P del Ti fue del 33% y del 16% para GTi. En TR 1+/2+, el GTi de mediana selectividad presentó una P del 33%/30% y el GTc de 26%/57%, respectivamente, que se incrementó al 66% para TR 3+, con escasa-selectividad. Las PBJ presentaron valores estables mediante BZT, con diluciones manuales o realizadas por el equipo. La PT-ur mediante los métodos de cuantificación ensayados resultaron comparables y el BZT mostró PT-ur variables en presencia de PBJ dependiendo de la dilución empleada. En todos los niveles de PT-ur fue posible identificar la P de todas las lesiones estructurales con selectividades progresivamente comprometidas.

Gammapatía monoclonal de significado incierto: factores de pronóstico, evolución y riesgo / Monoclonal gammopathy of undeterminaded significance: prognostic factor and risk of progression / Gamopatia monoclonal de significado indeterminado: fatores prognósticos: risco da evolução

La Gammapatía Monoclonal de Significado Incierto (GMSI) tiene una prevalencia que varía entre 1 y 3%, su frecuencia tiende a aumentar con la edad y aunque presentan evolución indolente y una sobrevida prolongada, un porcentaje de ellas desarrollará una enfermedad maligna. Con el objetivo de evaluar el valor pronóstico de diversos parámetros proteicos y hematológicos al momento del diagnóstico, se estudiaron mediante estudios proteicos completos en sangre y en orina, 407 pacientes con diagnóstico de GMSI que ingresaron a la institución en el período comprendido entre 1982 y 2008. La concentración del componente monoclonal (CM) (>1,5 g/dL) y el tipo inmunológico (No IgG), la disminución de las inmunoglobulinas no comprometidas (INC), el porcentaje de infiltración de células plasmáticas en médula ósea (>5%) y la mediana de las relaciones anormales de las cadenas livianas monoclonales libres, fueron los parámetros que marcaron riesgo de progresión a una enfermedad maligna. El estudio proteico completo de orina demostró una asociación entre el aumento en la concentración de proteínas de bajo peso molecular con valores de estimado de filtración glomerular menor de 60 mL/min/1,73 m2 y presencia de proteinuria de Bence Jones, independientemente del tipo de cadena liviana y de los niveles de proteínas totales. Debido a ello, la adición de dichos marcadores de daño tubular podría ofrecer una visión más profunda, siendo su aumento un posible indicador, en la profilaxis renal, de una severa lesión tubular futura. Finalmente, en pacientes con GMSI, los controles de laboratorio deberán ser ajustados en su periodicidad pero no en su contenido. La mayor información así obtenida será lo que permitirá una decisión médica más segura al momento de recomendar la frecuencia del seguimiento del paciente y la consiguiente detección temprana de una evolución maligna de la enfermedad.

Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico / Two dimensional electrophoresis in urine: an alternative for the clinical laboratory / Eletroforese bidimensional em urina: uma alternativa para o laboratório clínico

En este trabajo se presenta un método confiable para el análisis de rutina de proteínas urinarias. El método es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tinción argéntica. La electroforesis bidimensional abre el espectro de proteínas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometría de masa MALDI. Dichas proteínas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoproteína (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas están incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crónica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El método, no invasivo, se aproxima a la tecnología emergente de la proteómica que permite el análisis simultáneo de varias proteínas urinarias como una herramienta para el diagnóstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.

Seguimiento del perfil proteico urinario en el trasplante renal / Follow-up of urine protein profile in renal transplant

La nefropatía crónica del trasplante (NCT) se caracteriza por fibrosis intersticial y atrofia tubular, pero su etiología es diversa. El objetivo del trabajo fue evaluar el seguimiento cualitativo de proteínas urinarias en pacientes con más de seis años de trasplante renal y compararlo con parámetros de laboratorio y con biopsia renal. Se evaluaron 17 pacientes durante un año, a través de creatinina sérica, proteinuria y fraccionamiento proteico por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) en una y dos dimensiones con coloración argéntica. Todos los pacientes con biopsias características de nefropatía crónica del trasplante presentaron un perfil tubular y aquellos con glomerulopatía del trasplante evidenciaron un perfil predominantemente glomerular. Los cambios en el perfil tubular se asociaron a infecciones urinarias, pulmonares e intestinales y a una respuesta inmunológica en el límite al rechazo (borderline), aún sin modificaciones evidentes en la creatinina sérica ni en la proteinuria. La electroforesis bidimensional permitió detectar claramente las proteínas orosomucoide y zinc alfa-2 glicoproteína, aparentemente asociadas a hialinosis arteriolar por toxicidad causada por ciclosporina. La electroforesis SDS-PAGE permitió identificar el sitio de lesión en el nefrón y cambios en la evolución, aún en presencia de vestigios de proteinuria. Las electroforesis SDS-PAGE mono y bidimensional se plantean como complemento para la evaluación de la condición clínica del paciente trasplantado renal crónico.

Post-transplant chronic nephropathy is characterized by interstitial fibrosis and tubular atrophy. These alterations are non-specific, but the glomerular and vascular lesions help to differentiate the etiological causes. The aim of this study was to determine the qualitative follow-up study of urine proteins in patients, six years after receiving a renal transplant, and compare their relationship to laboratory parameters and renal biopsy. The evolution of 17 patients with renal transplant was studied for one year, through serum creatinine, proteinuria, and polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE) in one and two dimensions with silver staining. The patients with chronic nephropathy by renal biopsy presented a tubular profile of urinary proteins, and those who presented glomerulopathy showed a predominant glomerular profile. Changes in the tubular profiles during the follow-up study were associated to urinary tract, pulmonary, and intestinal infections, as well as borderline rejection, even without evident changes in either proteinuria or serum creatinine. The bidimensional electrophoresis clearly marked the orosomucoid proteins and zinc alpha-2 glycoprotein, generally associated to arterial hyalinosis due to ciclosporin toxicity. Even with traces of proteinuria, SDS-PAGE with silver staining made it possible to identify the renal lesion location. It also enabled the detection of the stable profiles of urinary proteins and changes in the evolution, without modification of serum creatinine. SDS-PAGE in one and two dimensions is used as a complement in the evaluation of renal transplant patients' clinical condition.

Validación post-analítica de la correlación inmunoglobulinas-gammaglobulinas / Post-analytical validation of the correlation between immunoglobulins-gammaglobulins

La electroforesis convencional en gel de agarosa con registro densitométrico (PRE) y la cuantificación de inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM (GAM) por inmunoturbidimetría permiten estimar el estado inmunológico humoral. Debido a las diferencias metodológicas, los resultados de GAM y la densitometría de la fracción gamma obtenida ( GAMMA OBT) del PRE, son difíciles de correlacionar. El objetivo del presente estudio fue establecer una forma de validación post-analítica entre ambos métodos. Se seleccionaron 1.057 sueros, 736 no presentaban componentes monoclonales en la electroforesis. Se determinó GAM en un autoanalizador Hitachi 917 (Tina-quant-Roche, EE.UU.). La GAMMA OBT se obtuvo por electroforesis mediante un sistema semiautomático (Hydragel-Protein) seguido de densitometría (Hyrys), SEBIA (París-Francia). Mediante regresión lineal múltiple sobre GAMMA OBT y GAM de los 736 sueros, se predijo el valor esperado de la fracción gamma (GAMMA ESP) en g/dL a partir de los resultados de GAM: GAMMA ESP=0,84xIgG+0,23xIgA+0,75xIgM (Error estándar: 0,009; 0,041; 0,050, respectivamente; r=0,955; p<0,0001). Para detectar anomalías, como la presencia de componentes monoclonales, se utilizaron los 1.057 sueros, obteniéndose para la diferencia entre la GAMMA ESP y la GAMMA OBT, los siguientes valores de corte: -0,21 y +0,18 g/dL, los cuales incluyen la región de menor incidencia de anomalías. Se determinó el cociente de cada inmunoglobulina respecto de su valor normal superior, estableciéndose 1,5 como valor de corte. Combinando ambos procedimientos se obtuvo una sensibilidad y especificidad global de 81,4%, y 76,6%, respectivamente, para la detección de anomalías. En el presente trabajo se expone el algoritmo de decisiones que luego se ha aplicado a otros 307 pacientes encontrándose 68,0% y 83,1% de sensibilidad y especificidad, respectivamente.

Conventional agarose gel electrophoresis (AE) followed by densitometric analysis and quantitation of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM (GAM) enable the evaluation of the immunological humoral status. Due to methodological differences, the results of the immunoglobulins quantitation by immunoturbidimetry (GAM), and the ones of the GAMMAAE region by densitometer tracing, are difficult to correlate. The aim of the present study was to establish a method of post-analytical validation between both procedures. One thousand and fifty-seven sera were selected, out of which 736 did not show any monoclonal components in the AE. GAM concentration was determined with a 917 Hitachi autoanalizer (Tina-quant-Roche). The GAMMA region was obtained by AE with a semiautomatic system (Hydragel Protein), followed by densitometer tracing (Hyrys, SEBIA). By means of the least-square multiple linear regression analysis of the GAMMA and GAM determinations of the 736 sera, the percentage fractions of each immunoglobulin corresponding to the GAMMA region were obtained: GAMMAGAM=0,84xIgG+0,23xIgA+0,75xIgM; (r=0.955; p<0.0001). In order to detect abnormalities such as the presence of monoclonal components, the 1057 sera were tested. The cut-off values for the normal difference between the GAMMAGAM and the GAMMAAEAE, were the following: -0.21;+0.18 (g/dL). The ratio of each immunoglobulin with respect to its higher normal value was determined, and the resulting cut-off value was 1.5. For the detection of abnormalities, a global sensitivity and specificity of 81.4%, and 76.6%, respectively was obtained by combining both procedures. In the present study the algorithm of decisions applied is shown.

Utilidad de la fosfatasa alcalina urinaria como marcador precoz de lesión tubular renal / Utility of urinary alkaline phosphatase as early marker of renal tubular failure

El objetivo de este estudio fue determinar la actividad de la fosfatasa alcalina urinaria (FALur) para evaluar precozmente lesión tubular y su utilidad diagnóstica. Los pacientes estudiados fueron: 20 Controles (C), 11 hipertensos (HTA), 23 diabéticos (DBT) y 34 con insuficiencia renal de diverso origen (IRDO). Se realizaron las determinaciones de: creatinina, clearence de creatinina (Jaffé cinético), FAL sérica y urinaria (cinético DGKC), microalbuminuria (inmunoturbidimétrico), proteiunuria (turbidimétrico), uroproteinograma, SDS-PAGE (al 12,5%) e isoenzimograma de FAL. La FAL sérica hallada fue normal, sin diferencia entre grupos y sin relación con el aumento de la FALur. El valor de corte recomendado para FALur fue de 8 UI/L. La FALur estuvo elevada en HTA e IRDO y normal en individuos con DBT. Los aumentos de FALur en IRDO se relacionaron con la lesión tubular estructural y en pacientes con HTA podrían relacionarse con alteración tubular precoz. Se propone la determinación de FALur para la detección temprana de lesión tubular ante falla renal establecida o en individuos con riesgo de desarrollarla, y se establece su utilidad en pacientes: - con DBT y HTA para seguimiento (junto a microalbuminuria y clearence de creatinina), - internados en riesgo de insuficiencia renal aguda: para orientar tratamientos, - con insuficiencia renal crónica: como indicador de lesión y pronóstico.

The objective of this study was to determine the activity of urinary Alkaline Phosphatase (ALPur) to evaluate early tubular failure and its diagnostic usefulness. The patients studied were: 20 Controls (C), 11 with Hipertensión (HTA), 23 Diabetic (DBT) and 34 with renal Insufficiency of diverse origin (IRDO). The creatinine, creatinine clearence (kinetic Jaffé) serum and urinary ALP (kinetic DGKC), microalbuminuria (Immunoturbidimetric), proteiunuria (Turbidimetric), uroproteinogram, SDS-PAGE (12.5%) and ALP isoenzymes determinations were made. The results indicate that serum ALP was normal, without difference between groups, and no relation with the increase in ALPur. Recommended cut-off value of ALPur was 8 UI/L. ALPur was elevated in HTA and IRDO, and normal in DBT. Increases in ALPur in IRDO were related to the structural tubular injury, and those in HTA could be related to early tubular alteration. Determination of ALPur is proposed for early detection of tubular injury, before renal failure is established or when there is risk of developing it, establishing its usefulness in: - DBT and HTA patients: screening (together with microalbuminuria and creatinine clearence). - Hospitalized patients in risk of acute renal insufficiency: in order to orient treatments. - Patients with chronic renal insufficiency: as an indicator of injury and prognosis.

Perfil proteico en líquido cefalorraquídeo: aporte al diagnóstico de esclerosis múltiple / Protein profile in cerebrospinal fluid: contribution to the diagnosis of multiple sclerosis

El presente estudio permitió determinar dos perfiles proteicos, mediante SDS-PAGE con tinción argéntica, en 104 líquidos cefalorraquídeos (LCR) de pacientes con diversas patologías. En el perfil A (PA) se observaron bandas de peso molecular (PM) 67 KDa. En el perfil B (PB) se observaron, además, bandas correspondientes a proteínas de bajo PM (20-25 KDa y 13 KDa). Se analizó la presencia de bandas oligoclonales (BO) mediante electroforesis y electroinmunofijación en acetato de celulosa con tinción argéntica, sin concentración previa. El análisis estadístico estableció una asociación entre la presencia de PB y esclerosis múltiple (EM) (p<0,0001) y la presencia de BO y EM (p<0,001) comparada con el resto de las neuropatías. Dentro del grupo de pacientes con PB se observó una asociación significativa entre la presencia de BO y el diagnóstico de EM (p<0,05). Tres pacientes sin EM presentaron BO positivas. El perfil proteico y la presencia de BO fueron útiles como herramientas diagnósticas adicionales para definir a la población de pacientes con EM. La utilización de ambas determinaciones fortalecería el aporte del Laboratorio al diagnóstico de EM, al evaluar dos eventos patológicos complementarios, la síntesis local de IgG (BO) y la destrucción axonal con liberación de proteínas de origen cerebral (PB)